科研人必知！Raw264.7炎症模型构建的黄金法则 | 上海富衡

构建RAW264.7细胞炎症模型是研究巨噬细胞介导的炎症反应及相关药物筛选的常用方法。

以下是详细的实验步骤和注意事项：

一、实验材料

细胞系：小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7（需确认细胞状态良好，无污染）。
刺激剂：
脂多糖（LPS等炎症刺激因子，常用浓度0.1-1 μg/mL）。
其他可选刺激剂：PMA（佛波酯）、IFN-γ（干扰素γ）、TNF-α等。一般可与LPS联合使用，提高炎症反应。
培养基：DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清（FBS） + 1%双抗（青霉素/链霉素）。
检测试剂：
ELISA试剂盒（检测TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子）。
实时荧光定量PCR（qPCR）试剂（检测炎症相关基因如iNOS、COX-2）。
Western blot试剂（检测NF-κB、MAPK信号通路蛋白）。
活性检测试剂（CCK-8、MTT或LDH）。

二、实验步骤

细胞培养
复苏与传代：
复苏后培养至第3代以上，确保细胞状态稳定。
铺板（以12孔板为例）：
以12孔板为例，制备2~5×105 cells/mL的细胞悬液，每孔接种500μL，贴壁过夜（12-16小时）。
炎症模型诱导
刺激剂处理：
A、炎症刺激因子（LSP等）处理：用含炎症刺激因子（LSP等）的培养基替换原培养基（常用浓度0.1-1 μg/mL，作用时间12-48小时）。
B、其他刺激剂：如IFN-γ（10-50 ng/mL）联合LPS可增强炎症反应。
对照组设置：
A、阴性对照：正常培养基（无刺激剂）。
B、阳性对照：已知有效的炎症诱导剂（如LPS标准浓度）。（可选）
检测炎症反应
炎症因子检测（可选）：
ELISA：收集细胞上清液，检测TNF-α、IL-6等分泌水平。
qPCR：提取细胞RNA，检测炎症基因（如TNF-α、IL-1β、iNOS）的mRNA表达。
信号通路分析：
Western blot：检测NF-κB p65核转位、IκBα降解，或MAPK通路磷酸化。
细胞活性检测：
使用CCK-8或MTT评估刺激剂对细胞存活率的影响，排除细胞毒性干扰。

炎症模型构建效果展示（ELISA法）

三、关键注意事项

细胞状态：
避免细胞过度融合（>90%），高密度可能自发分泌炎症因子。
传代时轻柔操作，减少机械刺激导致的异常激活。
刺激条件优化：
预实验确定最佳炎症刺激因子浓度和时间（不同批次LPS活性可能差异较大）。
若使用炎症刺激因子联合其他刺激剂（如IFN-γ），需优化配比。
无菌操作：
炎症刺激因子LPS易吸附于塑料表面，建议LPS溶液的保存使用低吸附管。