1. 常规消化：用胰酶（0.25% 胰蛋白酶 + EDTA）消化贴壁细胞，终止后离心（1000rpm，5min）收集细胞；

2. 重悬调整：用含10%-20% 胎牛血清（FBS）的完全培养基重悬细胞，调整密度至 1×10⁶ - 5×10⁶ cells/mL（密度过低易凋亡，过高易缺氧）；

3. 保存条件：将细胞悬液转入无菌离心管或培养瓶（密封，避免污染），4℃冷藏（代谢减缓，活性维持最佳），或室温（20-25℃，仅适用于 1 天内，需避免光照和温度波动）；

4. 复苏处理：保存后需立即离心（1000rpm，5min），弃上清，用新鲜完全培养基重悬后接种，24 小时内观察细胞贴壁情况（活率应≥80%）。

• 操作：贴壁细胞无需消化，直接更换新鲜完全培养基（液面覆盖细胞层即可，无需过多），密封培养瓶后 4℃冷藏；

• 风险：超过 2 天易出现细胞脱落、形态改变，复苏后需及时传代，淘汰漂浮死细胞。

1. 离心收集：1000rpm 离心 5min，弃旧培养基，去除代谢废物；

2. 重悬优化：用含 10%-20% FBS 的完全培养基重悬，调整密度至 2×10⁵ - 1×10⁶ cells/mL（避免密度过高导致营养耗尽）；

3. 保存条件：4℃冷藏（1-3 天）或室温（1 天内），期间可轻轻颠倒离心管 1-2 次，避免细胞沉降缺氧；

4. 复苏处理：直接取少量悬液接种至新鲜培养基（无需离心，减少损伤），24 小时观察细胞增殖状态。

3. 短期运输过程中的细胞保存（4℃为主，适配1-3天运输场景）

1. 细胞状态筛选：运输前24小时确保细胞处于对数生长期（活率≥90%），避免使用刚传代、汇合度＜50%或出现老化/污染迹象的细胞；

2. 容器选择：优先使用带密封盖的无菌离心管（50mL/15mL，贴壁细胞悬液）或培养瓶（悬浮细胞，需用 parafilm 密封瓶口，避免漏液），外层套入防震泡沫盒（厚度≥3cm）；

3. 培养基优化：统一使用含胎牛血清（FBS）的完全培养基（额外添加 1% 双抗（青霉素-链霉素），降低运输中污染风险）灌满整个培养容器，确保细胞在运输过程中的状态稳定；

• 无菌优先：所有操作在超净台进行，容器（离心管、培养瓶）需灭菌，避免细菌 / 真菌污染（短期保存中污染扩散极快）；

• 血清保护：必须添加血清（提供营养和抗凋亡因子），无血清培养基会导致细胞快速凋亡；

• 避免反复温差：4℃保存的细胞不可直接室温放置，需先在冰上过渡 10-15min，再逐步恢复至 37℃，防止温度冲击损伤细胞膜。

1. 预处理：选择对数生长期细胞（活性最佳），传代时调整接种密度至常规密度的 1.5 倍（如常规 1×10⁵ cells/cm²，中期保存用 1.5×10⁵ cells/cm²）；

2. 培养基优化：使用含 20% FBS 的完全培养基（高血清提供更多营养储备），添加 1% 双抗（青霉素 - 链霉素，降低污染风险）；

3. 保存环境：置于20-25℃室温（避光），无需 CO₂培养箱（低温下细胞对 CO₂需求降低）；

4. 维护操作：每 2 周更换 50% 培养基（吸弃上层旧培养基，加入等量新鲜培养基，避免完全换液导致环境波动）；

5. 复苏恢复：需使用时，将培养瓶转移至 37℃、5% CO₂培养箱，适应 24 小时后更换全量新鲜培养基，正常传代。

1. 离心调整：1000rpm 离心 5min，用含 20% FBS 的完全培养基重悬，调整密度至 5×10⁵ - 2×10⁶ cells/mL；

2. 保存容器：选择带透气盖的培养瓶（少量气体交换，避免缺氧），液面高度不超过培养瓶体积的 1/3（减少细胞沉降压迫）；

3. 定期维护：每 1 周轻轻颠倒培养瓶 3-5 次，使细胞均匀悬浮；若发现培养基变黄（pH 下降），需离心更换 50% 新鲜培养基；

4. 复苏恢复：转移至 37℃、5% CO₂培养箱，静置 1-2 小时后，取少量细胞计数，若活率≥70%，可直接传代；活率过低需淘汰。

• 细胞状态筛选：仅保存对数生长期细胞（停滞期或衰老细胞中期保存后易死亡），保存前需检测活率（≥90%）；

• 避免污染：中期保存时间长，需严格无菌操作，可在培养基中添加抗真菌剂（如 0.5μg/mL 两性霉素 B），预防真菌污染；

• 不适用细胞类型：原代细胞、敏感细胞（如干细胞、免疫细胞）不建议中期保存，易出现功能丧失或分化，优先选择短期或长期保存。

• 慢冻：控制降温速率（-1℃/min），让细胞内水分缓慢渗出，避免形成大冰晶（冰晶会刺破细胞膜导致细胞死亡）；

• 快融：37-40℃水浴快速解冻（1-2 分钟），减少冰晶在复温过程中对细胞的二次损伤；

• 冷冻保护剂（CPA）：分为渗透性（如二甲基亚砜 DMSO、甘油）和非渗透性（如蔗糖、牛血清白蛋白 BSA），作用是降低细胞冰点、减少冰晶形成、维持渗透压。

• 试剂：含 10%-20% FBS 的完全培养基、冷冻保护剂（常用 10% DMSO + 90% 完全培养基，或 5% 甘油 + 95% 完全培养基，DMSO 效果优于甘油，但对部分细胞有毒性）；

• 耗材：无菌冻存管（标注细胞名称、代数、冻存日期）、程序降温仪（或异丙醇降温盒）、液氮罐（提前检查液氮量）；

• 细胞准备：选择对数生长期细胞，贴壁细胞消化离心收集，悬浮细胞直接离心收集，离心条件均为 1000rpm，5min。

• 冻存液配置：在冰上缓慢混合 DMSO 和完全培养基（DMSO 需提前 4℃预冷，避免高温损伤细胞），严禁剧烈摇晃；

• 细胞重悬：用预冷的冻存液重悬细胞，调整密度至 1×10⁶ - 1×10⁷ cells/mL（密度过高易导致复苏后存活率下降），轻柔吹打均匀，避免产生气泡。

• 专业方案（程序降温仪）：设定降温程序（4℃平衡 10min → -1℃/min 降至 - 80℃ → 保持 1-2h → 转入液氮），精准控制速率，适用于所有细胞（尤其是敏感细胞）；

• 简易方案（异丙醇降温盒）：将冻存管放入含异丙醇的降温盒（提前 - 20℃预冷），直接放入 - 80℃冰箱，降温速率约 - 1℃/min，适用于常规细胞系（如 HeLa、293T），成本低但精度稍差；

• 禁止直接冷冻：不可将冻存管直接放入 - 80℃或液氮，会导致降温过快，冰晶大量形成，细胞死亡率＞90%。

• 转移时机：-80℃冷冻 1-2h 后，立即将冻存管转入液氮罐（气相区优先，温度 - 150℃至 - 196℃，避免直接浸入液相区，防止冻存管破裂导致交叉污染）；

• 记录管理：建立冻存台账，记录细胞位置（液氮罐层数、格子号）、名称、代数、冻存者，避免混乱。

1. 快速解冻：从液氮罐取出冻存管，立即放入 37-40℃水浴锅，轻轻摇晃至剩余少量冰晶（约 100μL），避免完全融化后继续水浴（防止过热损伤）；

2. 去除保护剂：在超净台内，将融化的细胞悬液缓慢加入含 10mL 完全培养基的离心管（稀释 DMSO，降低毒性），轻柔混匀；

3. 离心洗涤：1000rpm 离心 5min，弃上清（彻底去除 DMSO），用新鲜完全培养基重悬细胞；

4. 接种培养：将细胞接种至培养瓶，37℃、5% CO₂培养箱培养，24 小时后更换全量新鲜培养基（去除死细胞和残留 DMSO）；

5. 存活率检测：复苏后 24-48h 观察细胞状态，用台盼蓝染色检测活率（常规细胞系活率应≥70%，干细胞 / 原代细胞≥60% 为合格）。

• DMSO 毒性控制：DMSO 在室温下对细胞有毒性，需全程冰上操作，复苏时必须稀释并离心去除；对 DMSO 敏感的细胞（如神经元细胞），可替换为 5% 甘油或无血清冷冻保护剂（如 STEM-CELLBANKER）；

• 细胞质量把控：冻存前需检测细胞活率（≥90%）、无菌性（培养 24h 观察有无污染）、细胞身份（如 STR 鉴定，避免交叉污染）；

• 液氮罐维护：定期补充液氮（液面需覆盖所有冻存管），避免液氮耗尽导致细胞复温；气相区储存的冻存管需密封完好，防止液氮渗入（解冻时易爆炸）；

• 避免反复冻融：同一支冻存管不可多次复苏 - 冻存，会导致细胞大量死亡和遗传变异，建议按单次使用量分装冻存（如每管 0.5-1mL 细胞悬液）。

• 短期周转（数天）：4℃或室温保存，依赖高血清培养基维持活性；

• 中期暂停（数周）：20-25℃半静止培养（贴壁）或 4℃冷藏（悬浮），定期更换培养基；

• 长期储存（数年）：液氮冷冻保存，严格执行 “慢冻快融 + 冷冻保护剂”，把控细胞质量和操作细节。