细胞培养生物污染有哪些？这些无菌操作你都会吗？

细胞培养物污染往往是细胞培养实验室中最常见的问题，有时会造成非常严重的后果。细胞培养污染物可分为两大类，一类是化学污染物，如培养基、血清和水中的杂质，包括内毒素、增塑剂和洗涤剂，另一类是生物污染物，如细菌、霉菌、酵母、病毒和支原体，以及其他细胞系的交叉污染。虽然污染无法完全消除，但可以通过全面了解其来源并遵循良好的无菌技术来降低污染的发生频率和严重性。这里将概述主要的生物污染类型。

细菌是一大类普遍存在的单细胞微生物。细菌的直径通常只有几微米，其形状多样，如球状、杆状和螺旋状等。由于分布广泛、生长迅速和体积大小等特点，细菌以及酵母和霉菌是细胞培养中最常见的生物污染物。细菌污染在培养物感染后几天内就很容易被肉眼观察到；受感染的培养物通常会变得浑浊，有时表面会有一层薄膜。经常还会出现培养基的pH值突然下降的情况。在低倍显微镜下，细菌以细小颗粒的形式出现在细胞之间，在高倍显微镜下观察可以分辨出单个细菌的形状。下面的模拟图像显示了贴壁培养的293细胞被大肠杆菌污染。

酵母是真菌界中的单细胞真核微生物，大小从几微米（常见）到40µm（罕见）不等。与细菌污染一样，被酵母污染的培养物会变得混浊，尤其是在污染的后期。被酵母污染的培养物，其pH值几乎没有变化，通常直到污染严重时，pH值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵球形或球形颗粒，可能还会出芽产生更小的颗粒。下面的模拟图像显示了贴壁293细胞铺板24小时后被酵母感染的情况。

黑胶虫是一种生物还是非生物，学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清。黑胶虫的出现常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。黑胶虫生长与细胞的生长有此消彼长的关系，即当细胞状态好时小黑点会相应的减少；反之则增加，似乎有细胞竞争生长的关系。

黑胶虫污染的特点是起初对细胞并无影响，当达到一定数量时则会影响细胞生长。受黑胶虫污染的细胞液通常清亮无变化，在高倍显微镜下可以观察到点状片状的游动小体，做布朗运动。

支原体是最小的（0.3 μm）能够自我复制的有机体，倒置显微镜下通常观察不到。支原体没有细胞壁，对常用的抗生素不敏感。支原体感染是极为不易察觉的，可能直到出现了可以观察到的病变或发现细胞正常功能丧失的时候，才意识到是发生了支原体感染。一些生长缓慢的支原体可在培养物中持续存活，而不会导致细胞死亡，但它们可以改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢。慢性支原体感染的可能表现包括：细胞增殖率降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集；但是，检测支原体污染的唯一可靠方法是通过使用荧光染色（例如Hoechst33258染色）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或微生物测定法定期检测培养物。

霉菌是真菌界的真核微生物，以多细胞丝状体生长，称为菌丝。这些多细胞丝状体构成的交联网络含有遗传性相同的细胞核，被称为集落或菌丝体。与酵母污染相似，培养物的pH值在污染的初期保持稳定，然后随着培养物感染程度加剧而迅速增加，并变得浑浊。在显微镜下，菌丝体通常呈细长的丝状体，有时呈密集的孢子团。许多种霉菌的孢子在休眠阶段能够耐受极其恶劣和不宜生长的环境，当其遇到合适的生长条件时才会被激活。

病毒是一种微小的感染性病原体，利用宿主细胞的结构进行繁殖。它们的体积极小，难以在培养中被检测到，也难以从细胞培养实验室使用的试剂中去除。由于大多数病毒对宿主有非常严格的要求，因此，它们通常不会对宿主以外物种的细胞培养物产生不良影响。但被病毒感染的细胞培养物会对实验室人员造成严重的健康威胁，尤其是当实验室培养的是人类或灵长类的细胞时。要检测细胞培养物是否被病毒感染，可以使用电子显微镜观察、用抗体组合进行免疫染色、ELISA检测或是使用合适的病毒引物进行PCR扩增。

虽然不如微生物污染普遍，但许多细胞系与HeLa以及其他快速生长细胞系之间的广泛交叉污染已经是一个明确的问题，会产生严重的后果。从值得信赖的细胞库中获取细胞系，定期检查细胞系的特性，并使用良好的无菌技术进行操作，这些做法都将帮助您避免交叉污染。DNA指纹图谱分析、核型分析和细胞亚型分析可以确定细胞培养物中是否存在交叉污染。

请勿在常规细胞培养中使用抗生素，因为抗生素的连续使用会促进耐药菌株的生长，并导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养基中去除，就会发展成大规模污染。抗生素的持续使用还可能掩盖支原体感染和其他隐性污染。此外，某些抗生素可能会与细胞发生交叉反应，干扰正在研究的细胞过程。抗生素只能作为对付污染的最后手段且只能短期使用，并应尽快从培养物中去除。如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，作为检测隐性感染的对照。

细胞培养的成功在很大程度上取决于保护细胞免受细菌、真菌和病毒等微生物的污染。非无菌用品、培养基和试剂、带有微生物的空气悬浮微粒、不干净的培养箱以及工作台面都是生物污染的来源。

下面的清单简单罗列了一些建议和方法，可指导您切实使用无菌技术。有关无菌技术的深入介绍，请参阅《动物细胞培养：基本技术和特殊应用指南》（Freshney，2016年）。