上海富衡 | 点亮支原体,让污染无所遁形!——TaqMan探针法qPCR在支原体检测中的应用![]() 实时荧光探针PCR技术,又称为qPCR,是一种结合了PCR扩增和荧光检测的分子生物学技术。它能够在PCR反应进行的同时,实时监测特定DNA序列的扩增情况。该技术主要依赖于荧光标记的探针,这些探针能够特异性地结合到目标DNA序列上。 在PCR循环中,随着目标DNA的指数级扩增,荧光信号也相应增强。荧光信号的强度与扩增产物的量成正比,因此可以通过荧光信号的变化来实时监测PCR反应的进程。实时荧光探针PCR技术通常使用两种类型的荧光探针:TaqMan探针和SYBR Green。 SYBR Green是一种DNA染料,它能够非特异性地结合到双链DNA上,具有使用简便,价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性,即染料可以与任何dsDNA结合。因此,qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值,影响定量结果的准确性,而TaqMan探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题,这也让TaqMan探针法在检测领域大放异彩!接下来,就让我们了解一下TaqMan探针法qPCR在支原体检测方面的应用。 ![]() TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,它含有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当探针完整时,报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在PCR扩增过程中,TaqMan探针与目标DNA序列结合,Taq DNA聚合酶的5'到3'外切酶活性会切割探针,导致报告基团和淬灭基团分离,从而发出荧光信号。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比,因此,通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。 针对支原体16S rRNA序列,下载后进行序列比对,筛选支原体特异性的区段,寻找两端特异中间保守的区段,设计引物。一般选择多对正反向引物,和多条相对应的探针引物。 同时为了保证实验的有效性和稳定性,往往还会设计一对内参引物和内参荧光探针,用于监控每次反应过程的稳定性。 检测时需取培养至少2~3天的细胞培养物,进行核酸提取后,作为模板进行qPCR反应。 目前市场上优秀的qPCR(TaqMan探针法)支原体检测试剂盒可检测支原体种类可达到39~180种以上,检测灵敏度可达到10cfu/mL。 高灵敏度:该方法可以检测极低浓度的核酸模板,灵敏度高。 实时监测:在PCR反应过程中实时监测荧光信号,可以准确地定量分析。 多重检测能力:可以同时使用不同颜色的荧光标记,进行多重检测。 声明:此篇为上海富衡生物科技有限公司官网原创文章,转载请标明出处链接:https://www.fudancell.com/sys-nd/60.html
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