样本准备

将待测样品与含有支原体特异性引物、荧光染料、聚合酶和其他必要成分的qPCR反应混合液混合。
其中引物的设计是关键，它们需要特异性地结合支原体DNA的目标序列。

将配制好的反应体系置于qPCR仪中，进行PCR扩增。
在扩增过程中，荧光染料与双链DNA结合，产生荧光信号。
仪器会实时监测荧光强度的变化，并绘制扩增曲线。

根据扩增曲线，可以判断样本中是否存在支原体DNA，并计算其含量。
通常，通过设定阈值线，将扩增曲线与阈值线的交点所对应的循环次数（Ct值）作为判断依据。Ct值越低，表示样本中支原体含量越高。

为确保检测结果的准确性和可靠性，需要进行质量控制和验证。
这包括在洁净环境中（一般在超净台或生物安全柜中）配制反应体系，qPCR全程为闭管反应，检测时设置阴性对照和阳性对照等。